Jueves 30 de octubre

Esta semana realizamos una cuantificación de ADN con un electrofotométro, una PCR y su purificación.
Continuamos con la redacción del proyecto final.

Jueves 23 de octubre

En este encuentro realizamos una PCR y redactamos los resultados para el Proyecto Final.

Jueves 16 de octubre

En este encuentro buscamos mutaciones en los resultados de la secuenciación del ADN. Más tarde terminamos de redactar "Materiales y métodos" y redactamos las conclusiones.

Jueves 2 de octubre

En este encuentro realizamos una segunda PCR, una segunda purificación y finalmente lo secuenciamos . Continuamos con la redacción de "Materiales y métodos".

Jueves 25 de septiembre

En este encuentro realizamos una electroforesis y una PCR.
Comenzamos a redactar "Materiales y métodos" para el Proyecto Final.

Jueves 18 de septiembre

Al llegar a la Academia nos enteramos de un Ateneo que se estaba llevando a cabo en la planta baja del establecimiento. Concurrimos a la exposición sobre SAF (Sindrome Antifosfolipídico).
Al regresar al laboratorio realizamos una electroforesis (CSGE) y una PCR.

Jueves 4 de septiembre

En este encuentro realizamos una PCR. Mientras esperábamos que el termociclador terminara de amplificar hicimos una nueva extracción de ADN por el método explicado anteriormente.

Jueves 14 de agosto

El encuentro de hoy lo dedicamos a buscar la información que nos faltaba y terminar de redactar la Introducción para nuestro Proyecto Final.

Jueves 24 de julio

Esta semana revelamos el gel resultante de la electroforesis realizada la semana pasada. Primero lo fijamos con etanol (300ml), ácido acético (100ml) y agua (hasta completar el litro) dejando el gel durante 1h. Lo teñimos con nitrato de plata (0,5g cada 0,5l de solución preparada) durante 1h. Finalmente lo revelamos. Para esto, agregamos una solución de 21,6ml de formaldehido (0,4%), 30g NaOH (1,5%) y agua free (hasta completar los 2l). Después de este paso logramos visualizar las bandas obtenidas.

Jueves 17 de julio

Esta semana realizamos una electroforesis de los ADNs obtenidos a partir de hacer la PCR la semana pasada. Preparamos la cuba de 20 x 40, el gel (acrilamida, etilenglicol, buffer tristaurina EDTA, agua free, persulfato de amonio y temed), luego sembramos las muestras (los ADNs resultados de los 3 tipos de extracción de ADN diferentes, 2 normales y heterodúplex entre paciente y normal) y lo dejamos correr 24 hs. La semana que viene lo revelaremos y analizaremos los resultados.

Jueves 10 de julio

En este encuentro hicimos la PCR con la sangre almacenada en las mini-cards la semana pasada. Después de esto Adriana nos mostró el auditorio de la Academia, que tiene libros de varios siglos atrás expuestos en vitrinas. Finalmente nos quedamos escribiendo la introducción de este trabajo.

Fotos de hoy en: http://www.slide.com/r/pIseiEII0j9vrcs6doj5n2HfzCM_zmMY?previous_view=mscd_embedded_url&view=original

Jueves 3 de julio

Esta semana volvimos a extraer ADN y probamos los "Mini-cards" que le habían dejado a Adriana la semana anterior para que probara. Los mini-cards son unas tarjetas para almacenar muestras de sangre sin necesidad de congelarlas en tubos. Para esto se colocan algunos microlitros de sangre dentro de cada circunferencia dibujada en el cartón y se deja secar un tiempo. Hay diferentes tamaños de tarjetas y cada una necesita un tiempo diferente para secar. Además algunas tienen una sola circunferencia grande, mientras que otras tienen cuatro circunferencias, por lo que se puede guardar sangre de diferentes pacientes. También tienen un espacio para rotularlas. La próxima semana haremos una PCR usando la sangre almacenada de este modo.
Hoy también vimos las diferencias en la secuenciación del ADN de acuerdo a la cantidad de magnesio que se pone en la PCR.

Fotos de hoy en: http://www.slide.com/r/Xs6wkw4P1T8dyXDFTUeqN2KbDWnu35xs?previous_view=mscd_embedded_url&view=original

Jueves 26 de junio

Hoy volvimos a hacer PCR.
Vimos las diferencias en los resultados si se usa magnesio (izquierda) o se omite su uso (derecha).
Mientras esperábamos que el termociclador terminara de trabajar, buscamos información en carpetas que nos prestó Adriana y en una página de Internet recomendada por ella: www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed

Jueves 19 de junio

En este encuentro hicimos una electroforesis. Primero Adriana nos mostró cómo preparar las placas y preparó el gel. Para el gel usamos un buffer (tristaurinaEDTA), acrilamida con piperazina, etilenglicol, formamida, agua destilada, persulfato y temed.
La pipeta que usamos para la acrilamida debió ser descartada porque esta sustancia (sin polimerizar) es muy tóxica.
Tuvimos que hacer dos veces el gel porque no gelificaba.
Cuando estuvo lista la corrida la llevamos al transiluminador.
Adriana nos mostró fotocopias de geles y también algunos geles que tenía guardados y nos llevamos información para fotocopiar.

Fotos de hoy en: http://www.slide.com/r/dK0Ktq5E6z-ZwTjUdp-hN3zVFdFyHwiq?previous_view=mscd_embedded_url&view=original

Jueves 12 de junio

En este encuentro hicimos PCR, cuyo objetivo es amplificar con primers específicos un fragmento de ADN de interés.
Para el mix que le agregamos a las muestras de ADN usamos agua, buffer, DNTP, Mg, primers y TaqPol.
Se debe cumplir con determinadas condiciones:
· El primer debe tener 18 a 24 pares de bases y no puede tener poliC, poliG, poliA ni poliT.
· La temperatura de annealing (hibridación) no puede ser menor de 50ºC y debe ser aproximadamente 5ºC menor que la temperatura de melting.
· T. Melting = 4 (G+C) + 2 (A+T). Debe dar entre 40 y 60%.

También hicimos extracciones de ADN.

Fotos de hoy en: http://www.slide.com/r/hC4UVSGL0j-zkSzfLnulSrSSEI9Iar8N?previous_view=mscd_embedded_url&view=original

Jueves 5 de junio

En esta semana hemos comenzado a trabajar con pacientes que sufren la enfermedad Von Willebrand tipo 2N. Al igual que en el encuentro pasado extrajimos ADN de sangre cruda, utilizando el mismo método. Por falta de tiempo debimos concluir el práctico en esta parte para continuarlo la semana entrante.

Fotos de hoy en: http://www.slide.com/r/-J1Ctitc4D-zTFtNavZDg1CNXgAiAwYb?previous_view=mscd_embedded_url&view=original

Jueves 29 de mayo

En este tercer encuentro empezamos a trabajar, usando una muestra de sangre normal (sin la enfermedad). Para enseñarnos la técnica, Adriana preparaba un tubo y nosotras lo repetíamos por triplicado.

Primera parte:
En tubos eppendorf pusimos 500 ul de solución de lisis. Agregamos 300 ul de sangre entera, teniendo cuidado de que no se formaran burbujas. Mezclamos por evacuación de propipeta.
Agregamos 100 ul de solución de sucrosa 33% en la base de cada tubo, sin que se mezclaran las fases. Tapamos los tubos y centrifugamos a 13500 rpm durante 2 minutos.
Descartamos el sobrenadante teniendo cuidado de no sacar los pellets.
Lavamos con 300 ul de PBS, volviendo a mezclar por evacuación de pipeta.
Agregamos 100 ul de solución de sucrosa 11% en la base de cada tubo, sin que se mezclaran las fases. Tapamos y volvimos a centrifugar a 13500 rpm durante 2 minutos.
Nuevamente descartamos el sobrenadante teniendo cuidado de no sacar los pellets.
Agregamos 75 ul de NaOH y vortexeamos.
Incubamos en el termociclador a 95°C por 14 minutos y a 30°C por 1 minuto.
Centifugamos brevemente para bajar el agua de condensación de las paredes del tubo (usamos el botón "pulse").
Neutralizamos con 10,5 ul de Tris/ClH y centrifugamos 4 minutos a 14000 rpm.
El ADN se encuentra en el sobrenadante.
*Nota: Cada vez que un tip entra en contacto con la muestra hay que descartarlo para no contaminar las soluciones. Como estábamos usando sangre de una sola persona, poníamos la solución necesaria en cada tubo (sin tocar la muestra) y después mezclábamos por evacuación de pipeta. Cuando trabajemos con muestras de diferentes personas sí vamos a usar un tip para cada muestra.

Segunda parte:
Llevamos el ADN al tercer piso de la Academia, donde se encontraba el espectrofotómetro. Usamos una celda de cuarzo porque las celdas de plástico no trasmiten eficientemente la luz ultravioleta. Medimos las absorbancias a 230 nm, 260 nm (máxima absorción) y 280 nm.

Al concluir el práctico, la Dra. Woods continuó con la explicación teórica acerca de lo que realizaremos la semana entrante (PCR). Luego nos mostró el programa Oligo, utilizado para diseñar primers, que permite identificar los posibles problemas e inconvenientes del diseño (unión de la cadena, temperatura de annealing, de melting, contenido de bases G y C) para obtener el mejor primer posible a la hora de fabricarlo.

Fotos de hoy en: http://www.slide.com/r/IAbJpoLCwz-wsZcy8VSv8bYoiDEOg0_P?previous_view=mscd_embedded_url&view=original

Jueves 22 de mayo

En este segundo encuentro la doctora continuó con la explicación teórica de la enfermedad de Von Willebrand. Nos enseñó los distintos tipos de análisis que se realizan para detectarla: tiempo de sangría, ELISA (foto), etc.

Mediante un esquema Adriana nos explicó cómo se hereda la hemofilia; cuándo uno es portador (solo en mujeres), cuándo uno padece la enfermedad (solo en varones) y los casos de varones sanos.
Finalmente vimos los diferentes tipos de VWD (tipo 1, tipo 2A, 2B, 2M, 2N y tipo 3), qué los distingue y qué análisis se implementan para su diagnóstico.

Todos estos casos fueron ejemplificados para ver en qué rango de datos el paciente padece la enfermedad de Von Willebrand.

Jueves 15 de mayo

Hoy empezamos el proyecto. En este primer encuentro conocimos el lugar: la biblioteca, el área de atención a pacientes, los laboratorios, la dirección...
Luego la Dra. Adriana Woods, la investigadora con quien estaremos trabajando a lo largo del año, nos enseñó sobre la enfermedad de Von Willebrand (VWD) y la hemofilia. Aprendimos la cascada de la coagulación, los métodos de laboratorio para determinar las deficiencias cualitativas y cuantitativas de los distintos factores y las interacciones del factor de Von Willebrand (VWF) con las plaquetas, el factor VIII y el tejido subendotelial.

Fotos de hoy en: http://www.slide.com/r/kkyBq6nQ2j9kdVRyYkXMTANMgf1Bz1E3?previous_view=mscd_embedded_url&view=original