Jueves 29 de mayo

En este tercer encuentro empezamos a trabajar, usando una muestra de sangre normal (sin la enfermedad). Para enseñarnos la técnica, Adriana preparaba un tubo y nosotras lo repetíamos por triplicado.

Primera parte:
En tubos eppendorf pusimos 500 ul de solución de lisis. Agregamos 300 ul de sangre entera, teniendo cuidado de que no se formaran burbujas. Mezclamos por evacuación de propipeta.
Agregamos 100 ul de solución de sucrosa 33% en la base de cada tubo, sin que se mezclaran las fases. Tapamos los tubos y centrifugamos a 13500 rpm durante 2 minutos.
Descartamos el sobrenadante teniendo cuidado de no sacar los pellets.
Lavamos con 300 ul de PBS, volviendo a mezclar por evacuación de pipeta.
Agregamos 100 ul de solución de sucrosa 11% en la base de cada tubo, sin que se mezclaran las fases. Tapamos y volvimos a centrifugar a 13500 rpm durante 2 minutos.
Nuevamente descartamos el sobrenadante teniendo cuidado de no sacar los pellets.
Agregamos 75 ul de NaOH y vortexeamos.
Incubamos en el termociclador a 95°C por 14 minutos y a 30°C por 1 minuto.
Centifugamos brevemente para bajar el agua de condensación de las paredes del tubo (usamos el botón "pulse").
Neutralizamos con 10,5 ul de Tris/ClH y centrifugamos 4 minutos a 14000 rpm.
El ADN se encuentra en el sobrenadante.
*Nota: Cada vez que un tip entra en contacto con la muestra hay que descartarlo para no contaminar las soluciones. Como estábamos usando sangre de una sola persona, poníamos la solución necesaria en cada tubo (sin tocar la muestra) y después mezclábamos por evacuación de pipeta. Cuando trabajemos con muestras de diferentes personas sí vamos a usar un tip para cada muestra.

Segunda parte:
Llevamos el ADN al tercer piso de la Academia, donde se encontraba el espectrofotómetro. Usamos una celda de cuarzo porque las celdas de plástico no trasmiten eficientemente la luz ultravioleta. Medimos las absorbancias a 230 nm, 260 nm (máxima absorción) y 280 nm.

Al concluir el práctico, la Dra. Woods continuó con la explicación teórica acerca de lo que realizaremos la semana entrante (PCR). Luego nos mostró el programa Oligo, utilizado para diseñar primers, que permite identificar los posibles problemas e inconvenientes del diseño (unión de la cadena, temperatura de annealing, de melting, contenido de bases G y C) para obtener el mejor primer posible a la hora de fabricarlo.

Fotos de hoy en: http://www.slide.com/r/IAbJpoLCwz-wsZcy8VSv8bYoiDEOg0_P?previous_view=mscd_embedded_url&view=original

Jueves 22 de mayo

En este segundo encuentro la doctora continuó con la explicación teórica de la enfermedad de Von Willebrand. Nos enseñó los distintos tipos de análisis que se realizan para detectarla: tiempo de sangría, ELISA (foto), etc.

Mediante un esquema Adriana nos explicó cómo se hereda la hemofilia; cuándo uno es portador (solo en mujeres), cuándo uno padece la enfermedad (solo en varones) y los casos de varones sanos.
Finalmente vimos los diferentes tipos de VWD (tipo 1, tipo 2A, 2B, 2M, 2N y tipo 3), qué los distingue y qué análisis se implementan para su diagnóstico.

Todos estos casos fueron ejemplificados para ver en qué rango de datos el paciente padece la enfermedad de Von Willebrand.

Jueves 15 de mayo

Hoy empezamos el proyecto. En este primer encuentro conocimos el lugar: la biblioteca, el área de atención a pacientes, los laboratorios, la dirección...
Luego la Dra. Adriana Woods, la investigadora con quien estaremos trabajando a lo largo del año, nos enseñó sobre la enfermedad de Von Willebrand (VWD) y la hemofilia. Aprendimos la cascada de la coagulación, los métodos de laboratorio para determinar las deficiencias cualitativas y cuantitativas de los distintos factores y las interacciones del factor de Von Willebrand (VWF) con las plaquetas, el factor VIII y el tejido subendotelial.

Fotos de hoy en: http://www.slide.com/r/kkyBq6nQ2j9kdVRyYkXMTANMgf1Bz1E3?previous_view=mscd_embedded_url&view=original

Currículum de la Dra. Adriana Woods

CURRICULUM VITAE

ADRIANA INES WOODS



DATOS PERSONALES


NOMBRE Y APELLIDO: Adriana Inés Woods

LUGAR Y FECHA DE NACIMIENTO: Maciel (Santa Fé) 31-05-53

DOCUMENTO: DNI: 10.761.901
CI: 11.265.898 (Policía Federal)

ESTADO CIVIL: casada

DOMICILIO: Federico Lacroze 2367 7° B. Capital Federal. (CP: 1426)

TELEFONO: 4-772-2540

TITULO: Bioquímica (Universidad Nacional de Córdoba) 11-06-77

CARGO ACTUAL: Perteneciente a la Carrera del Personal de Apoyo de CONICET.
Categoría: profesional Principal.

LUGAR DE TRABAJO: Departamento de Hemostasia y Trombosis, Instituto de Investigaciones Hematológicas “Mariano R Castex”, Academia Nacional de Medicina.
Pacheco de Melo 3081, Buenos Aires.


ANTECEDENTES LABORALES EN EL CONICET

- Perteneciente a la Carrera del Personal de Apoyo de Conicet.

categoría: técnico profesional adjunto desde 10-3-83 hasta 31-7-91.

técnico profesional principal desde 1-8-91 a la actualidad.
ANTECEDENTES LABORALES DE PREGRADO

- Practicante ad-honorem del Laboratorio de Neonatología, Maternidad Provincial, ciudad de Córdoba, del 18-6-73 al 31-3-75.

- Practicante ad-honorem del Laboratorio Central, Hospital Nacional de Clínicas "Dr. Pedro Vella", ciudad de Córdoba, del 4-8-75 al 1-2-76.

- Practicante menor del Laboratorio Central, Hospital Nacional de Clínicas "Dr. Pedro Vella", ciudad de Córdoba por resolución n°DM 1904 de la Facultad de Ciencias Médicas de la U.N.C., del 1-2-76 al 31-12-76.

- Practicante mayor del Laboratorio Central, Hospital Nacional de Clínicas "Dr. Pedro Vella", ciudad de Córdoba por resolución N° de la Facultad de Ciencias Químicas de la U.N.C., del 1-1-77 al 30-6-77.

- Encargada del Consejo de Guardias del Laboratorio Central, Hospital Nacional de Clínicas "Dr. Pedro Vella", ciudad de Córdoba, del 1-3-77 al 31-7-77.

- Practicante mayor del Laboratorio de Análisis Clínicos, Cátedra de Clínica Oftalmológica, Hospital Nacional de Clínicas "Dr. Pedro Vella", ciudad de Córdoba, del 1-2-77 al 31-10-77.

CURSOS DE ACTUALIZACION DE PRE GRADO

- Respuesta Inmune. Asociación Bioquímica de Córdoba, set. 1975.

- Hematología. Escuela de Auxiliares de Medicina. Facultad de Ciencias Médicas, U.N.C., oct. 1975.

- Temas de Parasitología y Micología. Ateneo de Practicantes de Bioquímica. Unidad Académica de Medicina, Hospital "San Roque", Córdoba, del 17 al 21-11-75.

- Laboratorio Endócrino en Obstetricia. Asociación Bioquímica de Córdoba, 24/25-9-76 y 1/2-9-76.

- Sexto Curso de hematología, inmunología y hemoterapia. Instituto de Hemoterapia y Hematología. Hospital Nacional de Clínicas. U.N.C. del 11 al 16-10-76.

- Diabetes. UniMediCor, U.N.C., del 24 al 29-10-76.

- Enfermedad de Chagas Mazza. Asociación Bioquímica de Córdoba 5/6 y 12/13-8-77.

- Transplante Renal y Hemodiálisis. Centro Médico de Enfermedades del Riñon e Hipertensión Arterial.
Córdoba, 20-8-77.

- Hematología, Inmunohematología y Hemoterapia. Sociedad de Hematología y Hemoterapia de
Córdoba. del 22 al 26-08-77.

- Mesa Redonda sobre "Conductas en Medicina", Departamento de Formación Médica Laboratorios
Roemmers. Córdoba, set. 1977.

- XIV Curso de Inmunopatologías. Cátedra e Instituto de Alergia e Inmunopatología, Hospital Nacional
de Clínicas, Córdoba. del 7-8-77 al 9-10-77.

- Asistente a las VIII Jornadas y I Congreso Argentino de Micología. Córdoba. del 4 al 8-10-77.

- Diagnóstico Micológico e Inmunológico. VIII Jornadas y I Congreso Argentino de Micología. Córdoba,
del 5 al 7-10-77.


BECAS CONCURSADAS

- FECIC (Fundación para la Educación, la Ciencia y la Cultura), de 1-5-78 a 1-5-80.

Temas del Trabajo:
a) Comparación de una cefalina de cerebro humano y fosfolípido comercial en la realización del Tiempo de Tromboplastina Parcial Activado.
b) Estandarización de la técnica de disponibilidad del Factor Plaquetario 3.
c) Controles de Terapia Antitrombótica. Presentado ante la Sociedad Argentina de Investigación Clínica, Mar del Plata, noviembre de 1979.
d) Técnica de Detección de Microagregados Plaquetarios: intento de aplicación clínica.

Lugar de trabajo: Departamento de Hemostasia y Trombosis, Instituto de Investigaciones Hematológicas, Academia Nacional de Medicina.

- CONICET, de 1-4-80 a 1-4-82.

Categoría: Iniciación.

Tema de trabajo: Participación de las plaquetas en el sistema fibrinolítico.

Directora de beca: Dra María Angela Lazzari de López.

Lugar de Trabajo: Departamento de Hemostasia y Trombosis, Instituto de Investigaciones Hematológicas "Mariano R. Castex", Academia Nacional de Medicina. Buenos Aires.
PARTICIPACION EN CONGRESOS Y REUNIONES CIENTIFICAS

- Jornadas de Trombosis Arterial y Venosa. Grupo Cooperativo Latinoamericano de Hemostasia y
Trombosis (CLAHT). Bs As, 18/20-4-79.

- XXIV Reunión de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica. Mar del Plata, nov 1979.

- Sexto Congreso Latinoamericano de Hemostasia y Trombosis. Grupo Cooperativo Latinoamericano
de Hemostasia y Trombosis. Bs As, oct 1980.

- Semana de la Hematología Argentino-Británica. Instituto de Investigaciones Hematológicas "Mariano
R. Castex", Academia Nacional de Medicina. Bs As, set 1980.

- VII Reunión Iberoamericana de Hemostasia y Trombosis, San José de Costa Rica, julio 1981.

- VII International Congress on Thrombosis and Haemostasis. Toronto (Ontario), Canadá, julio 1981.

- XXVI Reunión Científica de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica. Mar del Plata, nov 1981.

- Simposio Buenos Aires '81. "Lípidos, Plaquetas y Trombosis". Grupo Cooperativo Latinoamericano
de Hemostasia y Trombosis. Bs As, 16/18-11-81.

- Semana de la Hematología Alemana. Bs As, oct 1982.

- Simposio Buenos Aires '83. "Terapéutica Antitrombótica". Grupo Cooperativo Latinoamericano de
Hemostasia y Trombosis. Bs As, set 1983.

- VIII Congreso Latinoamericano de Hemostasia y Trombosis. VIII Reunión de Trabajo del Grupo
Cooperativo Latinoamericano de Hemostasia y Trombosis. Montevideo, Uruguay, set 1983.

- XXVIII Reunión Científica de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica. Mar del Plata, nov 1983.

- Simposio Buenos Aires '84. "Interacción Pared Vascular-Plaquetas". Grupo Cooperativo Latino
americano de Hemostasia y Trombosis. Bs As, agosto 1984.

- XX Congreso de la Sociedad Internacional de Hematología. Bs As, 1/7-9-84.

- Semana de la Hematología Escandinava. Bs As, julio 1985.

- Simposio Buenos Aires '85. "Adhesividad y Agregación Plaquetaria, Farmacología y Clínica". Grupo
Cooperativo Latinoamericano de Hemostasia y Trombosis. Bs As, set 1985.

- I Reunión Científica del año 1986. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
Tema: Fibrinolisis. Bs As, 29-3-86.

- II Reunión Científica del año 1986. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
Tema: Enfermedad de von Willebrand. Bs As, 26-6-86.

- Simposio Buenos Aires '86. "Terapia Trombolítica: activador tisular del plasminógeno". Grupo
Cooperativo Latinoamericano de Hemostasia y Trombosis. Bs As, setiembre 1986.

- III Reunión Científica del año 1986. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
Tema: Experiencias y aplicaciones metodológicas de miembros del Grupo CAHT en diversos
Centros Internacionales en 1986. Bs As, octubre 1986.

- XI Congreso de la Asociación Latinoamericana de Farmacología. II Congreso de la Sociedad
Interamericana de Farmacología Clínica y Terapéutica. Bs As, 24/29-11-86.

- I Reunión Científica del año 1987. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
Tema: Uso de hemoderivados en pacientes con trastornos congénitos y adquiridos de la hemostasia.
Indicación y esquemas de tratamiento. Bs As, 5-6-87.

- International Congress on Thrombosis and Haemostasis. Bruselas, Bélgica, 6/10-7-87.

- II Reunión Científica del año 1987. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
Tema: Métodos objetivos de diagnóstico y tratamiento en trombosis. Bs As, 31-7-87.

- III Reunión Científica del año 1987. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
Tema: Desórdenes de la hemostasia en enfermedades neoplásicas. Bs As, 11-9-87.

- Simposio Buenos Aires '87. "Fisiología y tratamiento de las trombosis". Grupo Cooperativo
Latinoamericano de Hemostasia y Trombosis. Bs As, 14/16-9-87.

- IV Reunión Científica del año 1987. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
Tema: Tratamiento antitrombótico en diferentes patologías médicas. Córdoba, 27-11-87.

- I Simposio Internacional en Trombosis. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
Bs As, 11/13-4-88.

- Reunión Satélite del I Simposio Internacional en Trombosis. Grupo Cooperativo Argentino de
Hemostasia y Trombosis. Mendoza, 14/15-4-88.

- Jornadas Franco-Argentinas de Hematología. Bs As, 21/22-4-88.

- Jornadas Médicas sobre Trombosis y Anticoagulación. Fundación Roemmers. Bs As, 13/14-6-88.

- II Reunión Científica del año 1988. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis. Tema:
Desmopresina (DDAVP) en el tratamiento de los desórdenes de la hemostasia en diferentes
patologías. Bs As, 1-7-88.

- Simposio Buenos Aires '88. "Células endoteliales y trombosis". Grupo Cooperativo Latinoamericano
de Hemostasia y Trombosis. Bs As, 14/16-9-88.

- III Reunión Científica del año 1988. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis. Tema:
Inhibidores antifosfolípidos, aspectos clínicos, diagnóstico y tratamiento. Bs As, 28-11-88.

- II Simposio Educacional en Profilaxis y Terapéutica Antitrombótica. II Reunión Científica del Grupo
Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis. Bs As, 4/5-4-89.

- Reunión Satélite del II Simposio Educacional en Profilaxis y Terapéutica Antitrombótica; Grupo
Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis. Córdoba, 7-4-89.

- I Simposio Internacional de Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis y del Grupo
Cooperativo Latinoamericano de Hemostasia y Trombosis. Sociedad Argentina para el Estudio de la
Trombosis. Bs As, 29-5-89.

- III Reunión Científica del año 1989. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
“Causas de enfermedad trombótica congénita”. Bs As, 4-8-89.

- III Simposio Internacional del Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis. "Tendencias
actuales en el tratamiento de los trastornos trombóticos". Bs As, 9/11-5-90.

- Simposio Buenos Aires '90. "Aterogénesis y Trombogénesis, Fisiología y Tratamiento". Grupo
Cooperativo Latinoamericano de Hemostasia y Trombosis. Bs As, 5/7-9-90.

- II Reunión Científica del año 1990. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
"Participación de los leucocitos en la regulación de la hemostasia". Bs As, 18-10-90.

- III Reunión Científica del año 1990. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
"Moduladores endoteliales y trombosis". Bs As, 17-12-90.

- IV Simposio Internacional de Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis. "Nuevas
perspectivas terapéuticas en trombosis". Bs As, 9/11-4-91.

- II Reunión Científica del año 1991. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
" Trombosis y Hemostasia". Bs As, 14-6-91.
- Conferencia "Trombosis y Factores de Crecimiento y Proliferación de las Células Musculares Lisas
en Ateromatosis y Reestenosis Coronarias". Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y
Trombosis, Bs As, 16-9-91.

- Simposio: "Endotelio, Coagulación y Trombosis. Determinantes en el desarrollo de las lesiones
ateromatosas y de las reestenosis. Regresión de la Ateromatosis". Grupo Cooperativo Argentino de
Hemostasia y Trombosis, Bs As, 20-9-91.

- Medición de eicosanoides por EIA. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
Bs As, 11-10-91.

- III Reunión Científica del año 1991. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
Tema: "Trombosis en Neurología". Bs As, 6-11-91.

- XII Congreso Internacional del Grupo Cooperativo Latinoamericano de Hemostasia y Trombosis.
Bs As, del 18 al 22-11-91.

- I Reunión Científica del año 1992. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
Tema: "Coagulación y Trombosis en Obstetricia". Bs As, 10-4-92.

- V Simposio Internacional del Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis. "Nuevas
Perspectivas en Diagnóstico y Terapéuticas Antitrombóticas". Bs As, 6/8-5-92.

- Reunión Científica (tipo workshop). Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
Tema: "Tiempo de Sangría". Bs As, 8-5-92.

- II Reunión Científica del año 1992. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
Tema: "Heparinas de Bajo Peso Molecular y Terapéutica Antitrombínica". Bs As, 12-6-92.

- III Reunión Científica del año 1992. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
Tema: "Hígado y Coagulación". Bs As, 14-8-92.

- 56° Triduo Científico Anual. Asociación Bioquímica Argentina. Buenos Aires, 26 al 31-10-92.

- Simposio Buenos Aires 1992. Grupo Cooperativo Latino Americano de Hemostasia y Trombosis.
Tema: "Angioplastia Coronaria". Bs As, 1 y 2-12-92.

- II Reunión Científica del año 1993. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
Tema: "Anticoagulación Oral: puesta al día". Bs As, 18-6-93.

- Reunión Científica del I.I.Hema de la Academia Nacional de Medicina y la Fundación de la Hemofilia Argentina. Tema: “Presente y futuro del tratamiento de la hemofilia”. Bs As, 11-8-93.

- Simposio Buenos Aires 1993. Grupo CAHT. Tema: “Heparinas. tromboliticos y/o angioplastia en el
IAM”. Bs As, 15 y 16-11-93.

- II Reunión Científica Grupo CAHT, conjunta con el Consejo de Stroke de la SAC, Bs As, 24-4-95:
“Enfermedad coronaria en pacientes con TIA y stroke: prevalencia, implicancias pronosticas
y terapeuticas”.
22-5-95: Riesgo de embolias en lesiones cardiacas.
28-11-95: Trombofilia familiar, aspectos clínicos, diagnósticos y terapéuticos con especial enfoque
en TVP, trombosis y embolias arteriales y stroke isquémico en jóvenes.

- Conferencia Dr Dahlback (Suecia): Resistencia a la Proteína C activada como factor de riesgo en
trombosis venosa. Lab. Chromogenics y grupo CAHT, Bs As, 20-11-95.

- Reunión Científica conjunta SAETRO y Sociedad de Medicina Interna de Bs As. Homenaje a los
Maestros de la Hematología. 9-5-96.

- Jornadas Italo-Argentinas de Hematología, I.I.Hema, Academia Nacional de Medicina, 3/4-10-96.
- Ia Reunión Científica del año 1997. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
Tema: “Patología trombótica del embarazo”. Buenos Aires, 23-5-97.

- IIa Reunión Científica del año 1997. Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis.
Tema: “Estados protrombóticos”. Buenos Aires, 11-7-97.

- IIIa Congreso Argentino de Hemostasia y Trombosis. Grupo CAHT, Buenos Aires, 18 al 20-11-98

- XLIII Reunión anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica, Mar del Plata, 26/29/11/98.

- Jornadas Iberoamericanas de Hematología. I.I.Hema, Academia Nacional de Medicina, 14/16-4-99

- Simposio Internacional sobre Linfoma no Hodgkin. Revisión y Actualización, Fundación Roemmers,
6-8-1999.

- Ia. Reunión Científica del Grupo CAHT del año 2000. Tema: “Trombocitopenias”. 19-5-2000.

- IIa Reunión Científica del Grupo CAHT del año 2000. 30-6-2000.

- XLV Reunión anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica, Mar del Plata, 22-25/11/2000.

- Jornadas Británicas de Hematología. Total de horas: 13. IIHema, Academia Nacional de Medicina;
abril 2001.

- Simposio Internacional sobre Sindrome Plurimetabólico; Fundación Roemmers, 26-4-01.

- Simposio Internacional “Síndrome Urémico Hemolítico”, Academia Nacional de Medicina, junio 2001.

- Simposio Internacional sobre Enfermedad Vascular Trombótica; Fundación Roemmers, 19-10-01.

- XLVII Reunión anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica, Mar del Plata, 22-23/11/2002.

- Simposio sobre Hemostasia y Trombosis, Grupo CAHT, Fundación Margulies, 29/11/02.

- Asistencia y presentación de trabajos en el XIX Congress y 49th Annual SSC Meeting of the
Internacional Society on Trombosis and Haemostasis. Birmingham, UK, 12-18 Julio de 2003.

- Simposio sobre Hemostasia y Trombosis, Grupo CAHT, Fundación Margulies, 8/8/03.

- Congreso Conjunto de Sociedades Biomédicas, Mar del Plata, 16-20/11/04.

- Cuarta Reunión Científica Grupo CAHT, Del Viso, Pilar, 26/11/04.

- Jornadas Norteamericanas de Hematología. IIHema, Academia Nacional de Medicina, 14 y 15/04/05.

- Simposio Internacional sobre Complicaciones Hemorrágicas y Tromboembólicas de la Oncología.
Fundación Roemmers, Academia Nacional de Medicina, 1/7/05.

- Simposio Internacional de Glicoproteínas. Homenaje al Premio Nobel Luis F. Leloir. Academia Nacional de Medicina y Academia nacional de Ciencias Exactas, físicas y Naturales. 12/9/06.

- Molecular Immunology of Protozoan Infections. HHMI, EMBO, WHO, ANPCyT, CONICET, UNU-
BIOLAC, CABBIO, 19 y 20/3/07.

- Presentación Dr. Jorge di Paola (Universidad de Iowa) 29/3/07, Instituto Lanari.
Tema: modificadores genéticos del factor von Willebrand

- Jornadas Canadienses de Hematologia. IIHema. Academia Nacional de Medicina, 19 y 20/4/07.

- XX Congreso del Grupo Latinoamericano de Hemostasia y Trombosis (CLAHT) - VIII Congreso del
Grupo Argentino de Hemostasia y Trombosis (CAHT). Del 23 al 26 de abril de 2008.
CURSOS DE POST GRADO

- Curso de Trombosis, Instituto de Investigaciones Hematológicas "Mariano R. Castex", Academia Nacional de Medicina. Buenos Aires. 12/22-05-78.

- Curso de Hemostasia, Instituto de Investigaciones Hematológicas "Mariano R. Castex", Academia Nacional de Medicina. Buenos Aires. 24/28-5-78.

- Curso Teórico Práctico “Metodología de Investigación y Bioestadística”, I.I.Hema, Academia Nacional de Medicina, los días 1, 8, 15, 22 y 29-9-1999.

- Curso organizado por PE Biosystems de Brasil “Secuenciación de ADN en el ABI PRISM 310 Genetic Analyzer”. 8/12-11-1999

- Curso Teórico Práctico “Introducción a la citometría de flujo”; total de horas: 8. I.I.Hema, Academia Nacional de Medicina, 7 y 8 de Junio de 2001.

- Curso de Bioestadística Básica, de 80 horas cátedra, con evaluación final aprobada. Centro de Investigaciones Epidemiológicas, Academia Nacional de Medicina, Julio de 2001.

- Curso de Bioestadística Avanzada, de 70 horas cátedra, con evaluación final aprobada. Centro de
Investigaciones Epidemiológicas, Academia Nacional de Medicina, noviembre de 2001.

- Diagnóstico molecular en medicina. Su aplicación a enfermedades genéticas, tumorales e
infecciosas; con evaluación final aprobada. Centro de Investigaciones sobre Porfirinas y Porfirias
(CIPYP). Departamento de Quimica Biológica. FCEyN, UBA 9/17-12-02.

- Meta-análisis. Centro de Investigaciones Epidemiológicas, Academia Nacional de Medicina, del
16/3 al 18/5 de 2004.

- Principios y aplicaciones de la interferencia por RNA (siRNA), Sociedad Argentina de Investigación
Clínica, Consejo de Genética, 31/8/05.

- Diagnóstico molecular en medicina. Su aplicación a enfermedades genéticas, tumorales e infecciosas 2005 con evaluación final aprobada (90 hs de duración). Centro de Investigaciones sobre Porfirinas y Porfirias (CIPYP). Departamento de Química Biológica. FCEyN, UBA. 8/25-11-05.

- Minicurso: Biosíntesis Combinatoria: Nueva tecnología para la Generación de Agentes Terapéuticos. Llevado a cabo durante la 50° Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica, Mar del Plata, del 29 al 2 de dic de 2005.

- Minicurso: Análisis e Interpretación de Datos de Microarrays. GE Healthcare Bio-Sciences. Molecular Classification of Prostate Tumors Using Intronic Arrays. Llevado a cabo durante la 50° Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica, Mar del Plata, del 29 al 2 de dic de 2005.

- Minicurso: Técnicas de Mutagénesis Aplicadas al Estudio de la Estructura y Función de Proteínas. Llevado a cabo durante la 50° Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica, Mar del Plata, del 29 al 2 de dic de 2005.



PUBLICACIONES EN REVISTAS CON REFERATO

1- Meschengieser S, Woods AI, Schattner M, Lazzari MA: Asociación de fenómenos hemorrágicos y trombóticos en sindromes mieloproliferativos. Medicina (Bs.As.) 41:267-273, 1981.

2- Woods AI, Sutton NM, Kempfer A, Casillas G, Lazzari MA: Utilización del plasma ultrasonicado como diluyente en la técnica de dosificación de cofactor de ristocetina. Sangre 30:999-1006, 1981.

3- Woods AI, Vargas J, Berri G, Kreutzer G, Meschengieser S, Lazzari MA: Antithrombotic therapy in children and adolescent. Thromb. Res. 42:289-301, 1986.

4- Woods AI and Lazzari MA: Aspirin effect on platelet antiplasmins release. Thromb Res. 47:269-277, 1987.

5- Meschengieser S, Blanco A, Woods AI, Maugeri N, Fernández J, Dupont J, Lazzari MA: Intraplatelet levels of FvW:Ag and fibrinogen in myeloproliferative disorders. Thromb. Res. 48:311-320, 1987.

6- Woods AI. and Lazzari MA: Aspirin effect on the release of plasminogen activators inhibitors by human platelets. Thromb. Res. 52:119-125, 1988.

7- Farías C, Kempfer A, Blanco A, Woods AI, Lazzari MA: Visualization of the multimeric structure of von Willebrand Factor by immunoenzymatic stain using Avidin-Peroxidase Complex instead of Avidin-Biotin-Peroxidase Complex. Thromb. Res. 53:513-518, 1989.

8- Woods AI, Frontroth JP, Lazzari MA: Effect of protease inhibitors on the ristocetin cofactor activity. Rev. Iberoamer. Tromb. Hemostasia. 2:47-48, 1989.

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41- Woods AI, Meschengieser SS, Blanco AN, Lazzari MA. Incidence of major haemorrhages related to surgery in type 1 von Willebrand's disease. J Thromb Haemost, 2003 (a 1682).

42- Carballo GA, Kempfer AC, Woods AI, Farias CE, Lazzari MA. Comparative study of conformation sensitive gel electrophoresis and DNA sequencing for polymorphisms and mutation detection in von Willebrand disease type 2N. J Thromb Haemost, 2003 (a 1681).

43- Farias C, Kempfer AC, Amaral MM, Woods AI, Nadal MV, Carballo GA, Meschengieser SS, Lazzari MA. Virtual decrease of von Willebrand Factor-cleaving protease (ADAMTS 13) after infusion of desmopressin (DDAVP). J Thromb Haemost, 2003 (a 1675).

44- Carballo GA, Woods AI, Vera E, Casais P, Aletti G, Farías C, Kempfer AC, Lazzari M A. Genetic Study Of von Willebrand Factor In Twenty-two Members Of An Argentinian Family. J Thromb Haemost, 2005 (a 863).

45- Woods AI; Blanco AN; Nadal MV; Meschengieser SS; Grosso SH; Lazzari MA. Evaluation of Fibrinolytic Activity and major hemorrhages in Probable Type 1 von Willebrand Disease. J Thromb Haemost, 2005 (a 263).

46- Woods AI, Keller L, Kempfer AC, Farias CR, Casais P, Lazzari MA. CSGE to scan the exon 22 of von Willebrand factor gene for diagnosising von Willebrand disease 2N. Pathophysiol Haemost Thromb 35 (1-2), Proceedings and Abstracts from the 19th International Congress on Thrombosis. Tel Aviv, Israel, May 2006.

47- Casais P, Meschengieser S, Kempfer C, Woods A, Sanchel Luceros A, Lazzari MA. Pregnancy of type 2B vWD. World Federation of Haemophilia Congress 2006. Vancouver, Canada. 30 PO 906.

48- Woods AI, Sanchez-Luceros A, Blanco AN, Grosso SH, Kempfer AC, Lazzari MA. Is there any correlation between fibrinolytic activity and bleeding score in type 1 and possible type 1 von Willebrand disease?. J Thromb Haemost 2007; vol 5, Suppl 2. (P- W 178).

49- Kempfer AC, Farias C, Powazniak Y, Woods AI, Calderazzo J, Keller L, Lazzari MA. VWF-cleaving serine proteases isolation different from ADAMTS 13. J Thromb Haemost 2007; vol 5, Suppl 2. (P- M 298).

50- Keller L, Woods AI, Kempfer AC, Farías CE, Sanchez-Luceros A, Grosso SH, Lazzari MA.
An association of Vicenza and Normandy variants von Willebrand disease (VWD). J Thromb Haemost 2007; vol 5, Suppl 2. (P- W 161).

51- Kempfer AC, Keller L, Farias C, Woods AI, Sanchez-Luceros A, Powazniak Y, Carrivale M, Lazzari MA. abstract N° 1321 - Three new polymorphisms located in the intron 2 of the ADAMTS 13 gene. J Thromb Haemost 2007; vol 5, Suppl 2 (P- M 297).

52- Sanchez-Luceros A, Meschengieser SS, Turdó K, Woods AI, Kempfer AC, Blanco AN, Lazzari MA. Biological and Clinical response to desmopressin in children with von Willebrand disease. J Thromb Haemost 2007; vol 5, Suppl 2. (P- S 248).

53- Woods AI, Blanco AN, Grosso SH, Calderazzo JC, Meschengieser SS, Lazzari MA. Diagnóstico diferencial entre VWD tipo 3 y tipo 1 severo mediante la respuesta al DDAVP del tiempo de lisis de euglobulinas. XX Congreso del Grupo CLAHT; VIII Congreso del Grupo CAHT (P- 135).

54- Carrivale M, Kempfer AC, Woods AI, Vizcaychipi K, Astudillo OG, Sánchez Luceros A, Lazzari MA. Identificación de pacientes con acortamiento de la sobrevida del factor von Willebrand (VWF). XX Congreso del Grupo CLAHT; VIII Congreso del Grupo CAHT (P- 116).

55- Gross S, Bastos L, Ingratti M, Vizcaychipi K, Woods AI, Meschengieser SS, Blanco AN, Lazzari MA. VWD e inhibidor lúpico: curvas de dilución de FBI en la evaluación de la respuesta al DDAVP. XX Congreso del Grupo CLAHT; VIII Congreso del Grupo CAHT (P- 084).


ACTIVIDAD DOCENTE

- Curso de actualización realizado por el Instituto Nacional de Investigaciones Cardiológicas. Buenos Aires, octubre 1980.
Tema: Participación de las plaquetas en el mecanismo de coagulación. Actividad coagulante plaquetaria.

- Curso paralelo al VI Congreso de Hemostasia y Trombosis. Grupo Cooperativo Latinoamericano de Hemostasia y Trombosis. Buenos Aires, octubre 1980.
Tema: Participación de las plaquetas en el mecanismo de coagulación. Actividad coagulante plaquetaria.

- Curso de actualización para médicos cardiólogos, realizado por la División Cardiología del Hospital Durand. Buenos Aires, abril 1981.
Tema: Controles de laboratorio en el tratamiento con anticoagulantes orales.

- Curso de Hemostasia y Trombosis para graduados, realizado por la Asociación Bioquímica Argentina. Buenos Aires, octubre 1981.
Temas: Ultraestructura plaquetaria. Participación de las plaquetas en el mecanismo de la coagulación. Actividad coagulante plaquetaria.

- Curso de Hemostasia y Trombosis. Laboratorios ESSEX. Buenos Aires, octubre 1981.
Tema: Ultraestructura plaquetaria. Participación de las plaquetas en el mecanismo de coagulación.

- Curso de Hemostasia y Trombosis, paralelo al V Congreso Argentino de Bioquímica, realizado por la Asociación Bioquímica Argentina. Buenos Aires, 01/06-11-81.
Tema: Ultraestructura plaquetaria. Participación de las plaquetas en el mecanismo de coagulación. Actividad coagulante plaquetaria.

- Curso de Hematología y Hemostasia de post grado, realizado por el Hospital Interzonal de Agudos "Dr. Gregorio Alfaro". Colegio Bioquímico de la Provincia de Buenos Aires, 19-8-85.
Tema: Tromboelastografía.

- Curso de actualización y sistematización de patología Hematológica, realizado por la Sociedad Argentina de Hematología, Buenos Aires 30-06-86.
Tema: Pruebas para el estudio de la función plaquetaria: tiempo de sangría, adhesividad plaquetaria in vitro, cofactor de ristocetina, microagregados plaquetarios circulantes, estudios de degranulación: marcación con mepacrina.

- Curso de actualización realizado por el Departamento de Hemostasia y Trombosis. Instituto de Investigaciones Hematológicas "Mariano R. Castex", Academia Nacional de Medicina.
Tema: Participación de las plaquetas en el mecanismo de coagulación. Actividad coagulante plaquetaria. Factor Plaquetario 3, Factor Plaquetario 4 y ß-Tromboglobulina: bioquímica e interés clínico. Detección de microagregados plaquetarios circulantes: determinación y aplicación clínica. Control de laboratorio en el tratamiento de anticoagulantes orales. Cofactor de ristocetina: determinación y utilidad clínica. Enfermedad de von Willebrand: clasificación. Proteínas específicas plaquetarias. De 1979 a 1993.

- Curso de actualización realizado por el Departamento de Hemostasia y Trombosis. Instituto de Investigaciones Hematológicas "Mariano R. Castex", Academia Nacional de Medicina. Módulo 1: “Enfermedad de von Willebrand”. Desde 1994 a la actualidad.
Tema: Cofactor de ristocetina en plasma y plaquetas: determinación y utilidad clínica.

- Reunión Conjunta del I.I.Hema, Academia Nacional de Medicina y la Asociación Argentina de Hemoterapia e Inmunohematología. Módulo Práctico “Citometria de Flujo”. Bs As, 27-11-98.
Tema: Determinación de cofactor de ristocetina en plasma, plaquetas, y crioprecipitados.

- Módulo de Hemostasia de la Carrera de Especialistas en Bioquímica Clínica, área Hematología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA; 8-6-2000.
Tema: “Cofactor de Ristocetina: determinación bioquímica e implicancias clínicas”

- Curso de Actualización Profesional 2000. “Coagulación y Plaquetas: Aspectos técnicos”. Asociación Argentina de Técnicos en Laboratorio de Análisis Clínicos. 14/7/2000.
Tema: Determinación de cofactor de ristocetina en plasma, plaquetas y crioprecipitados: determinación y utilidad clínica.

- Curso Teórico-Práctico de Hemostasia y Trombosis realizado por el Departamento de Hemostasia y Trombosis, 2002. Instituto de Investigaciones Hematológicas "Mariano R. Castex", Academia Nacional de Medicina. Módulo: Metodología aplicada al estudio de marcadores de riesgo trombótico.
Tema: Determinación de cofactor de ristocetina en plasma, plaquetas y crioprecipitados: determinación y utilidad clínica.

- Curso teórico práctico “Actualización en Hemostasia y Trombosis” realizado por el Departamento de Hemostasia y Trombosis, 2003. Instituto de Investigaciones Hematológicas "Mariano R. Castex", Academia Nacional de Medicina.
Tema: “Actividad del cofactor de ristocetina: Agregación con ristocetina.
Actividad del cofactor de ristocetina en crioprecipitados y concentrados de FVIII/VWF.

- Curso teórico práctico “Actualización en Hemostasia y Trombosis” realizado por el Departamento de Hemostasia y Trombosis, 16-23-5-2005. Módulo 1: Alteraciones de la Coagulación, con un total de 1:30 hs cátedra. Instituto de Investigaciones Hematológicas "Mariano R. Castex", Academia Nacional de Medicina.
Tema: Factor von Willebrand. Enfermedad de von Willebrand, sus variantes.
Actividad del cofactor de ristocetina en plasma y plaquetas. Agregación con ristocetina.
Actividad del cofactor de ristocetina en crioprecipitados y concentrados de FVIII/VWF.
Técnicas de screening para búsqueda de mutaciones para el VWD 2 N.

- Curso teórico práctico organizado por la Carrera de Especialista en Bioquímica Clínica, área hematología, 31-5-2006, Módulo Hemostasia: “Enfermedad de von Willebrand, diagnóstico y clasificación”.

- Disertante en la II Reunión Científica de la Sociedad Argentina de Hematologia sobre “Importancia del Diagnóstico molecular de Mutaciones en Hematología”, 27/4/07.
Tema: “Enfermedad de von Willebrand: biología molecular, detección de mutaciones”.

- Curso teórico práctico “Actualización en Hemostasia y Trombosis” realizado por el Departamento de Hemostasia y Trombosis, del 13 al 14/9/2007. Módulo III: Factor Von Willebrand, con un total de 10 hs cátedra. Instituto de Investigaciones Hematológicas "Mariano R. Castex", Academia Nacional de Medicina.
Tema: Factor von Willebrand. Enfermedad de von Willebrand, variantes.
Actividad del cofactor de ristocetina en plasma y plaquetas. Agregación con ristocetina.
Biología molecular en la enfermedad de vo Willebrand.
Técnicas de screening para búsqueda de mutaciones para el VWD 2 N.

- Curso organizado por la Carrera de Especialista en Bioquímica Clínica, área Hematología, 15-4-2008, Módulo Hemostasia: “Factor von Willebrand, generalidades. Enfermedad de von Willebrand, diagnóstico y clasificación. Prueba de Cofactor de ristocenina en plasma y plaquetas. Agregación con ristocetina. Biología molecular de la vWD, técnicas de screening, secuenciación.

PARTICIPACIÓN EN PROYECTOS DE INVESTIGACION

A cargo de sub-proyectos en los proyectos dirigidos por la Dra María A. Lazzari que se describen a continuación:
-1995 PID 332360092.
-1997 PICT 0173 (PIP 4640/96). "Pared vascular, leucocitos, plaquetas y factor von Willebrand, su
intervención en la trombosis".
-1998 Proyecto N 05-00000-00706 ANPCyT. "Fisiología de las plaquetas, leucocitos y células
endoteliales mediada por interacciones celulares y factor von Willebrand".
-1999 Proyecto CONICET PIP n° 02066. "El factor von Willebrand. Sus interacciones fisiopatológicas.
Enfermedad de von Willebrand"
-2000 Proyecto ANPCyT PICT n° 8875. "Fisiopatología de las interacciones celulares y humorales en
la pared vascular".
-2002 Proyecto ANPCYT nº 0511270. Tema: “Alteraciones estructurales del Factor von Willebrand de células endoteliales producidas por plasma de embarazadas normales y por proteasas purificadas. Mutaciones y polimorfismos más frecuentes de la ADAMTS 13”.
-2004 Proyecto ANPCyT n° 25434. Tema: .ADAMTS-13: aislamiento, cuantificación en plaquetas (RT-PCR) evaluación en patologías y modelos “in vivo”-“in Vitro”.
-2004 Proyecto CONICET PIP n° 6026. Tema: VWF y ADAMTS-13, biología molecular, cuantificación del mRNA en plaquetas. Semejanza y diferencia en endotelio placentario. Evaluación en patologías humanas y modelos animales.

PREMIOS Y DISTINCIONES OBTENIDAS

- Premio "Elsa Arini de Masnatta", otorgado por la Academia Nacional de Medicina. Buenos Aires, octubre 1988.
Tema: Alteraciones plaquetarias y del complejo FVIII/Factor von Willebrand en sindromes mielo proliferativos. Meschengieser S, Blanco A, Maugeri N, Woods A, Bermejo E, Dupont J, Fernández J, Pieroni G, Lazzari M.A.

- Reach the Developing World Travel Grant. Otorgado por la International Society on Thrombosis and Haemostasis. XIX Congress and 49° Annual SSC Meeting.
Trabajo premiado: Woods AI, Meschengieser SS, Blanco AN, Lazzari MA. Incidence of major haemorrhages related to surgery in type 1 von Willebrand's disease. XIX Congress and 49th Annual SSC Meeting. International Society on Thrombosis and Haemostasis. Birmingham, UK. jul12-18, 2003.

- Segundo Premio del Subsidio a la Investigación ORT 2003 “Proyecto Química ORT del Genoma Humano” (95 puntos) con el tema “Diagnóstico de la enfermedad de von Willebrand (VWD) tipo 2N por técnicas genotípicas y fenotípicas”.

- Subsidio a la Investigación ORT 2004 “Proyecto Química ORT del Genoma Humano” con el tema “Diagnóstico de la enfermedad de von Willebrand (VWD) tipo 2N por técnicas genotípicas y fenotípicas”.

- Subsidio a la Investigación ORT 2005 “Biología molecular y Proteómica 2005” con el tema: VWF y Adamts-13: biología molecular.

- Subsidio a la Investigación ORT 2006 en Bioquímica Molecular y Proteómica con el tema: Diagnóstico de la enfermedad de von Willebrand (VWD) tipo 2N por técnicas fenotípicas y genotípicas.

- Subsidio a la Investigación ORT 2007 en Bioquímica Molecular y Proteómica con el tema: " Estudio genotípico de ADAMTS-13 en pacientes con microangiopatías trombóticas"

- Subsidio a la Investigación ORT 2008 en Bioquímica Molecular y Proteómica con el tema: Diagnóstico de la enfermedad de von Willebrand (VWD) tipo 2N por técnicas fenotípicas y genotípicas.

-
COLABORACION EN CAPITULOS DE LIBROS

Técnicas de Hemostasia y Trombosis. Grupo Cooperativo Latinoamericano de Hemostasia y Trombosis, 2° Edición. Editores: C. Campos Guerra, L. Kordich, J.C. Sanchez Avalos, O. Vidal.
- Detección de microagregados plaquetarios circulantes: determinación, interpretación y utilidad clínica.
- Cofactor de ristocetina: determinación, interpretación y utilidad clínica.

Manual de Técnicas. Instituto de Investigaciones Hematológicas "Mariano R. Castex", Academia Nacional de Medicina. Editores: Luis J Bergna, Maria A Lazzari.
- Detección de microagregados plaquetarios circulantes: detección, interpretación y utilidad clínica.
- Cofactor de ristocetina: determinación, interpretación y utilidad clínica.
- Actividad coagulante plaquetaria.

Fundamentos para el manejo práctico en el laboratorio de hemostasia. Grupo Cooperativo
Argentino de Hemostasia y Trombosis, 1° Edición: 2003. Editor en jefe: Lucía Kordich.

Capítulo Factor VIII: Factor von Willebrand:
- Actividad de cofactor de ristocetina (VWF:RCo) en plasma. Pag 295.
- Factor von Willebrand Intraplaquetario. Actividad de cofactor de ristocetina (VWF:RCo). Pag. 305.

Capítulo Plaquetas: Metodología de Estudio:
- Determinación de microagregados plaquetarios circulantes. Pag 124.

VARIOS

- Miembro del Grupo Cooperativo Latinoamericano de Hemostasia y Trombosis (CLAHT) desde 1980.

- Miembro del Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis (CAHT) desde 1981.

- Concurrencia al Instituto de Investigaciones Henry Beaufour, París, Francia, del 15 al 25-07-87, donde se trataron diferentes proyectos de investigación con su Director, el Dr. Eduardo Pirotski, concerniente al efecto del PAF y el BN 52021 (su inhibidor específico) sobre la liberación de antiplasminas y antiactivadores del plasminógeno (PAI-1) de las plaquetas.

- Secretaria del Simposio Internacional en Trombosis. Buenos Aires, Buenos Aires, 11/13 de abril de 1988.

DIAGNOSTICO DE LA ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND (VWD) TIPO 2N POR TECNICAS FENOTIPICAS Y GENOTIPICAS

El proyecto se desarrollará en el Instituto de Investigaciones Hematológicas "Mariano R. Castex" de la Academia Nacional de Medicina


INVESTIGADORAS:

María A. Lazzari. Subdirectora del Instituto de Investigaciones Hematológicas “Mariano R. Castex”. Academia Nacional de Medicina. CONICET.
Adriana I. Woods. CONICET.
Leticia Keller. Biotecnóloga, Academia Nacional de Medicina.



INTRODUCCION

La enfermedad de von Willebrand (vWD) es la enfermedad hemorrágica humana más frecuente (1) (hasta el 1% en algunas poblaciones) y es producida por la alteración del factor von Willebrand (vWF), cuya forma de herencia es autosómica, aunque pueden presentarse casos adquiridos asociados a sindromes linfo y mieloproliferativos. La vWD puede clasificarse en tres categorías principales: los tipos 1 y 3 son deficiencias cuantitativas y los tipo 2 que son deficiencias cualitativas de la molécula de vWF. El tipo 3 es el menos frecuente, presenta niveles de vWF muy bajos o ausentes y se hereda de manera recesiva; en el tipo 2, aunque la proteína puede estar presente, es funcionalmente defectuosa y se subclasifica en 4 grupos: tipo 2A, 2M, 2B y 2N (2) con características genotípicas y fenotípicas diferentes en cada subtipo.

El tipo 2N de la vWD (también llamada variante Normandy) se caracteriza por presentar bajos niveles de Factor VIII (FVIII) en comparación con niveles normales o subnormales de vWF y se hereda de manera recesiva (3). Hasta ahora, se encontró que estos pacientes eran homocigotas o doble heterocigotas para una serie de mutaciones localizadas entre los dominios D' y D3 (4).

La estabilización del dominio D' requiere puentes disulfuro y de cisteína (5), pero algunos autores sugieren que otros residuos aminoacídicos (aa), también son necesarios para mantener la conformación funcional de este sitio. Se sugiere que el potencial cambio conformacional inducido por la mutación Asp116Asn ubicada en el dominio D3 podría explicar la pérdida de capacidad de unión del vWF al FVIII. También podría afectar la formación de puentes disulfuro intercadena involucrados en la unión de los dímeros del vWF para formar los multímeros. Un subgrupo de vWD tipo 2N coheredó una mutación tipo 2N en un alelo y una mutación del tipo 1 o del tipo 3 en el otro alelo. La expresión del vWF recombinante mutado confirmó que la sustitución de un sólo aa produce la disminución en la capacidad de unión al FVIII (6).

OBJETIVOS

· Detección de pacientes con enfermedad de von Willebrand tipo 2N mediante técnicas fenotípicas y genotípicas. Secuenciación de los exones 17 al 24 del ADN de los pacientes con vWD para el diagnóstico de vWD 2N para encontrar las mutaciones y polimorfismos conocidos.

Búsqueda de nuevas mutaciones y polimorfismos en los exones 25 al 28, ya en el dominio D3, pues serían capaces de producir cambios conformacionales en el dominio D' que alteren la unión del vWF al FVIII.

Calcular la prevalencia en nuestro medio de la variante Normandy dentro de la vWD. Calcular las frecuencias alélicas de los distintos polimorfismos presentes en diferentes exones del vWF para compararlas con las registradas en el DATABASE de vWF de los distintos grupos étnicos.

Utilizar la técnica de Conformation-Sensitive Gel Electrophoresis (CSGE) como método de “screening” mediante la formación de heteroduplex, con el fin de detectar si existe alguna alteración en un determinado exón.

En el caso de detectar un patrón electroforético alterado de los exones en el CSGE, realizaremos la secuenciación de los mismos para identificarla.

RESULTADOS ESPERADOS

Los resultados de la secuenciación del ADN de los pacientes nos permitirá relacionar la sintomatología clínica de los mismos con sus alteraciones moleculares, determinar la prevalencia de esta variante en nuestra población y encontrar nuevos polimorfismos y mutaciones.

METODOLOGIA Y PLAN DE TRABAJO

Selección de las muestras por métodos fenotípicos de screening:

1. Determinación del antígeno del vWF (vWf:Ag) por inmunoelectroforesis, según la técnica de Laurell con anticuerpo anti-vWF policlonal (DAKO A082) en agarosa al 1%.
2. Determinación de FVIII por método en una etapa, empleando como reactivo, plasma deficiente en FVIII.
3. Determinación del Cofactor de Ristocetina. La ristocetina produce aglutinación de las plaquetas en presencia del vWF, a través de un receptor en la membrana plaquetaria, la glicoproteína Ib; los multímeros de alto peso molecular son necesarios para esta interacción mientras que los multímeros pequeños serían inactivos en ese aspecto. Esta determinación la realizamos por la técnica de Macfarlane.
4. Método de enlace del FVIII al vWF. Se eligen los pacientes que presentan niveles disminuídos de FVIII (VN: 0.5-1.5 U/dl) y valores normales o subnormales de vWF:Ag (VN: 0.5-1.5 U/dl) y de vWF:RCo (VN: 0.5-1.5 U/dl). La capacidad de unión del FVIII al vWF se determinará empleando una técnica de ELISA descrita previamente (7). El fundamento consiste en incubar las muestras de referencia y de los pacientes en tubos de poliestirene revestidos con anti-vWF policlonal al cual se unirá el complejo FVIII/vWF de las muestras. El FVIII endógeno se elimina con CaCl2 y se incuban los tubos con FVIII purificado comercial. El FVIII unido se determina por la técnica de sustratos cromogénicos.

Agrupamiento de los pacientes con enlace leve o muy disminuido.

En base a los resultados de la técnica anterior, se establece un cociente entre el enlace del vWF al FVIII del paciente y su nivel de vWF:Ag. Hasta un valor de 0.8 se considera un enlace normal, inferior al mismo, se considera leve o muy disminuido.
Extracción de ADN de glóbulos blancos.

Las muestras de sangre deben ser recolectadas con EDTA al 2%. Se utilizará un kit comercial (Wizard Genomic DNA Purification Kit de Promega). La técnica se realizará siguiendo las indicaciones del fabricante.

Reacción de la polimerasa en cadena (PCR).

Una vez extraído el ADN debe realizarse la amplificación del mismo por PCR. Esta reacción se lleva a cabo usando 0.2 uL de Taq polimerasa 0.5 U/mL, 1 µg de ADN, 100 pM de cada primer adecuado a la mutación que se estudie, 200 µmol/L de cada deoxinucleótido trifosfato (dNTP) y cloruro de magnesio.

Los siguientes primers ya han sido probados y permiten la amplificación adecuada de los exones correspondientes:

Exón 17 Primers: forward: 5’ GTG GAG GCA GCG AGT ATA G 3’
reverse: 5’ CGT GAG GAA TCT GGG CGA G 3’
Exón 18 Primers: forward: 5' CCA AAG GAC AGT GTG GAA GGT AGG 3'.
reverse: 5' CCT GCC TAC AAG AAA ACT GAA GGG 3'.

Exón 19 Primers: forward: 5' GGG TTT AGA TCA GTC ACT GTG 3'.
reverse: 5' GTG CAC CCT CAC TCC ACC CGC 3'.

Exón 20 Primers: forward: 5' GAT GGG CCC CTC AAA CCC AAG GTG 3'.
reverse: 5' CTC ACC TGC ACC AGA ACG TAC TGG 3'.

Exón 21 Primers: forward: 5' TTC TGG TCT GGT GAG AGC CAG TGG 3'.
reverse: 5' GCT TGG AAA TGT TCC TAT TAA GTG 3'.

Exón 23 Primers: forward: 5' TTC CCC TGA GCC GGA GAG GAT GCT 3'.
reverse: 5' GGA CAT TCC AGG AAG CAA GCT CTA 3'.

Exón 24 Primers: forward: 5'ATA ACC CCA GTT TGA CCA GCT GAC 3'.
reverse: 5'TCA CAC TCT GTG TCC ATA CCT CCA 3'.

Condiciones de la PCR para los exones 18, 19, 20, 21, 22, 23 y 24:
94ºC; 0:30min [94°C;0:30 min/58°C;1:00min/72°C;1:00 min] x 40 ciclos; 72°C;10:00 min.

Para el exón 17 la temperarura de annealing (TA) es de 56 °C.

Para los exones 25, 26, 27 y 28 diseñaremos los primers específicos para las amplificaciones y probaremos su funcionamiento.

Secuenciación del ADN de las muestras de los pacientes.

Para aislar el fragmento amplificado correspondiente al exón de interés, se purificará el producto de PCR mediante columnas de purificación específicas. A partir de esta purificación, se realizará una segunda PCR llamada reacción de secuenciación con el primer específico (forward o reverse) más el DNA sequencing kit de manera de amplificar una sola cadena de ADN. Las condiciones de la reacción de secuenciación son: 94°C; 3:00min [94°C;30 seg/50°C;15seg/60°C;4:00 min] x 25 ciclos. Se purifican los productos de la reacción de secuenciación por precipitación con: etanol absoluto, acetato de sodio 3 M, pH 4.8 y agua estéril libre de DNAsa. El producto purificado se resuspende en TSR (template supression reagent) y se procede a la secuenciación de las muestras en el equipo ABI Prism 310 Perkin Elmer.

CSGE (Conformation Sensitive Gel electrophoresis).

El CSGE se utiliza para detectar mutaciones ó polimorfismos basándose en la propiedad de que el cambio de un sólo nucleótido puede alterar la movilidad electroforética del producto de PCR bajo condiciones desnaturalizantes moderadas (8). En estas condiciones las moléculas de ADN tienen una conformación tridimensional estable que depende de la secuencia de nucleótidos. Por lo tanto, el cambio de un sólo nucleótido produce un cambio conformacional que puede ser detectado como un incremento en la migración diferencial de homoduplex y heteroduplex en una electroforesis en poliacrilamida.

Estadística.

Utilizaremos el test de Fisher o el chi cuadrado dependiendo del n que obtengamos y consideraremos un valor de a significativo si es <>