DIAGNOSTICO DE LA ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND (VWD) TIPO 2N POR TECNICAS FENOTIPICAS Y GENOTIPICAS

El proyecto se desarrollará en el Instituto de Investigaciones Hematológicas "Mariano R. Castex" de la Academia Nacional de Medicina


INVESTIGADORAS:

María A. Lazzari. Subdirectora del Instituto de Investigaciones Hematológicas “Mariano R. Castex”. Academia Nacional de Medicina. CONICET.
Adriana I. Woods. CONICET.
Leticia Keller. Biotecnóloga, Academia Nacional de Medicina.



INTRODUCCION

La enfermedad de von Willebrand (vWD) es la enfermedad hemorrágica humana más frecuente (1) (hasta el 1% en algunas poblaciones) y es producida por la alteración del factor von Willebrand (vWF), cuya forma de herencia es autosómica, aunque pueden presentarse casos adquiridos asociados a sindromes linfo y mieloproliferativos. La vWD puede clasificarse en tres categorías principales: los tipos 1 y 3 son deficiencias cuantitativas y los tipo 2 que son deficiencias cualitativas de la molécula de vWF. El tipo 3 es el menos frecuente, presenta niveles de vWF muy bajos o ausentes y se hereda de manera recesiva; en el tipo 2, aunque la proteína puede estar presente, es funcionalmente defectuosa y se subclasifica en 4 grupos: tipo 2A, 2M, 2B y 2N (2) con características genotípicas y fenotípicas diferentes en cada subtipo.

El tipo 2N de la vWD (también llamada variante Normandy) se caracteriza por presentar bajos niveles de Factor VIII (FVIII) en comparación con niveles normales o subnormales de vWF y se hereda de manera recesiva (3). Hasta ahora, se encontró que estos pacientes eran homocigotas o doble heterocigotas para una serie de mutaciones localizadas entre los dominios D' y D3 (4).

La estabilización del dominio D' requiere puentes disulfuro y de cisteína (5), pero algunos autores sugieren que otros residuos aminoacídicos (aa), también son necesarios para mantener la conformación funcional de este sitio. Se sugiere que el potencial cambio conformacional inducido por la mutación Asp116Asn ubicada en el dominio D3 podría explicar la pérdida de capacidad de unión del vWF al FVIII. También podría afectar la formación de puentes disulfuro intercadena involucrados en la unión de los dímeros del vWF para formar los multímeros. Un subgrupo de vWD tipo 2N coheredó una mutación tipo 2N en un alelo y una mutación del tipo 1 o del tipo 3 en el otro alelo. La expresión del vWF recombinante mutado confirmó que la sustitución de un sólo aa produce la disminución en la capacidad de unión al FVIII (6).

OBJETIVOS

· Detección de pacientes con enfermedad de von Willebrand tipo 2N mediante técnicas fenotípicas y genotípicas. Secuenciación de los exones 17 al 24 del ADN de los pacientes con vWD para el diagnóstico de vWD 2N para encontrar las mutaciones y polimorfismos conocidos.

Búsqueda de nuevas mutaciones y polimorfismos en los exones 25 al 28, ya en el dominio D3, pues serían capaces de producir cambios conformacionales en el dominio D' que alteren la unión del vWF al FVIII.

Calcular la prevalencia en nuestro medio de la variante Normandy dentro de la vWD. Calcular las frecuencias alélicas de los distintos polimorfismos presentes en diferentes exones del vWF para compararlas con las registradas en el DATABASE de vWF de los distintos grupos étnicos.

Utilizar la técnica de Conformation-Sensitive Gel Electrophoresis (CSGE) como método de “screening” mediante la formación de heteroduplex, con el fin de detectar si existe alguna alteración en un determinado exón.

En el caso de detectar un patrón electroforético alterado de los exones en el CSGE, realizaremos la secuenciación de los mismos para identificarla.

RESULTADOS ESPERADOS

Los resultados de la secuenciación del ADN de los pacientes nos permitirá relacionar la sintomatología clínica de los mismos con sus alteraciones moleculares, determinar la prevalencia de esta variante en nuestra población y encontrar nuevos polimorfismos y mutaciones.

METODOLOGIA Y PLAN DE TRABAJO

Selección de las muestras por métodos fenotípicos de screening:

1. Determinación del antígeno del vWF (vWf:Ag) por inmunoelectroforesis, según la técnica de Laurell con anticuerpo anti-vWF policlonal (DAKO A082) en agarosa al 1%.
2. Determinación de FVIII por método en una etapa, empleando como reactivo, plasma deficiente en FVIII.
3. Determinación del Cofactor de Ristocetina. La ristocetina produce aglutinación de las plaquetas en presencia del vWF, a través de un receptor en la membrana plaquetaria, la glicoproteína Ib; los multímeros de alto peso molecular son necesarios para esta interacción mientras que los multímeros pequeños serían inactivos en ese aspecto. Esta determinación la realizamos por la técnica de Macfarlane.
4. Método de enlace del FVIII al vWF. Se eligen los pacientes que presentan niveles disminuídos de FVIII (VN: 0.5-1.5 U/dl) y valores normales o subnormales de vWF:Ag (VN: 0.5-1.5 U/dl) y de vWF:RCo (VN: 0.5-1.5 U/dl). La capacidad de unión del FVIII al vWF se determinará empleando una técnica de ELISA descrita previamente (7). El fundamento consiste en incubar las muestras de referencia y de los pacientes en tubos de poliestirene revestidos con anti-vWF policlonal al cual se unirá el complejo FVIII/vWF de las muestras. El FVIII endógeno se elimina con CaCl2 y se incuban los tubos con FVIII purificado comercial. El FVIII unido se determina por la técnica de sustratos cromogénicos.

Agrupamiento de los pacientes con enlace leve o muy disminuido.

En base a los resultados de la técnica anterior, se establece un cociente entre el enlace del vWF al FVIII del paciente y su nivel de vWF:Ag. Hasta un valor de 0.8 se considera un enlace normal, inferior al mismo, se considera leve o muy disminuido.
Extracción de ADN de glóbulos blancos.

Las muestras de sangre deben ser recolectadas con EDTA al 2%. Se utilizará un kit comercial (Wizard Genomic DNA Purification Kit de Promega). La técnica se realizará siguiendo las indicaciones del fabricante.

Reacción de la polimerasa en cadena (PCR).

Una vez extraído el ADN debe realizarse la amplificación del mismo por PCR. Esta reacción se lleva a cabo usando 0.2 uL de Taq polimerasa 0.5 U/mL, 1 µg de ADN, 100 pM de cada primer adecuado a la mutación que se estudie, 200 µmol/L de cada deoxinucleótido trifosfato (dNTP) y cloruro de magnesio.

Los siguientes primers ya han sido probados y permiten la amplificación adecuada de los exones correspondientes:

Exón 17 Primers: forward: 5’ GTG GAG GCA GCG AGT ATA G 3’
reverse: 5’ CGT GAG GAA TCT GGG CGA G 3’
Exón 18 Primers: forward: 5' CCA AAG GAC AGT GTG GAA GGT AGG 3'.
reverse: 5' CCT GCC TAC AAG AAA ACT GAA GGG 3'.

Exón 19 Primers: forward: 5' GGG TTT AGA TCA GTC ACT GTG 3'.
reverse: 5' GTG CAC CCT CAC TCC ACC CGC 3'.

Exón 20 Primers: forward: 5' GAT GGG CCC CTC AAA CCC AAG GTG 3'.
reverse: 5' CTC ACC TGC ACC AGA ACG TAC TGG 3'.

Exón 21 Primers: forward: 5' TTC TGG TCT GGT GAG AGC CAG TGG 3'.
reverse: 5' GCT TGG AAA TGT TCC TAT TAA GTG 3'.

Exón 23 Primers: forward: 5' TTC CCC TGA GCC GGA GAG GAT GCT 3'.
reverse: 5' GGA CAT TCC AGG AAG CAA GCT CTA 3'.

Exón 24 Primers: forward: 5'ATA ACC CCA GTT TGA CCA GCT GAC 3'.
reverse: 5'TCA CAC TCT GTG TCC ATA CCT CCA 3'.

Condiciones de la PCR para los exones 18, 19, 20, 21, 22, 23 y 24:
94ºC; 0:30min [94°C;0:30 min/58°C;1:00min/72°C;1:00 min] x 40 ciclos; 72°C;10:00 min.

Para el exón 17 la temperarura de annealing (TA) es de 56 °C.

Para los exones 25, 26, 27 y 28 diseñaremos los primers específicos para las amplificaciones y probaremos su funcionamiento.

Secuenciación del ADN de las muestras de los pacientes.

Para aislar el fragmento amplificado correspondiente al exón de interés, se purificará el producto de PCR mediante columnas de purificación específicas. A partir de esta purificación, se realizará una segunda PCR llamada reacción de secuenciación con el primer específico (forward o reverse) más el DNA sequencing kit de manera de amplificar una sola cadena de ADN. Las condiciones de la reacción de secuenciación son: 94°C; 3:00min [94°C;30 seg/50°C;15seg/60°C;4:00 min] x 25 ciclos. Se purifican los productos de la reacción de secuenciación por precipitación con: etanol absoluto, acetato de sodio 3 M, pH 4.8 y agua estéril libre de DNAsa. El producto purificado se resuspende en TSR (template supression reagent) y se procede a la secuenciación de las muestras en el equipo ABI Prism 310 Perkin Elmer.

CSGE (Conformation Sensitive Gel electrophoresis).

El CSGE se utiliza para detectar mutaciones ó polimorfismos basándose en la propiedad de que el cambio de un sólo nucleótido puede alterar la movilidad electroforética del producto de PCR bajo condiciones desnaturalizantes moderadas (8). En estas condiciones las moléculas de ADN tienen una conformación tridimensional estable que depende de la secuencia de nucleótidos. Por lo tanto, el cambio de un sólo nucleótido produce un cambio conformacional que puede ser detectado como un incremento en la migración diferencial de homoduplex y heteroduplex en una electroforesis en poliacrilamida.

Estadística.

Utilizaremos el test de Fisher o el chi cuadrado dependiendo del n que obtengamos y consideraremos un valor de a significativo si es <>