Jueves 29 de mayo

En este tercer encuentro empezamos a trabajar, usando una muestra de sangre normal (sin la enfermedad). Para enseñarnos la técnica, Adriana preparaba un tubo y nosotras lo repetíamos por triplicado.

Primera parte:
En tubos eppendorf pusimos 500 ul de solución de lisis. Agregamos 300 ul de sangre entera, teniendo cuidado de que no se formaran burbujas. Mezclamos por evacuación de propipeta.
Agregamos 100 ul de solución de sucrosa 33% en la base de cada tubo, sin que se mezclaran las fases. Tapamos los tubos y centrifugamos a 13500 rpm durante 2 minutos.
Descartamos el sobrenadante teniendo cuidado de no sacar los pellets.
Lavamos con 300 ul de PBS, volviendo a mezclar por evacuación de pipeta.
Agregamos 100 ul de solución de sucrosa 11% en la base de cada tubo, sin que se mezclaran las fases. Tapamos y volvimos a centrifugar a 13500 rpm durante 2 minutos.
Nuevamente descartamos el sobrenadante teniendo cuidado de no sacar los pellets.
Agregamos 75 ul de NaOH y vortexeamos.
Incubamos en el termociclador a 95°C por 14 minutos y a 30°C por 1 minuto.
Centifugamos brevemente para bajar el agua de condensación de las paredes del tubo (usamos el botón "pulse").
Neutralizamos con 10,5 ul de Tris/ClH y centrifugamos 4 minutos a 14000 rpm.
El ADN se encuentra en el sobrenadante.
*Nota: Cada vez que un tip entra en contacto con la muestra hay que descartarlo para no contaminar las soluciones. Como estábamos usando sangre de una sola persona, poníamos la solución necesaria en cada tubo (sin tocar la muestra) y después mezclábamos por evacuación de pipeta. Cuando trabajemos con muestras de diferentes personas sí vamos a usar un tip para cada muestra.

Segunda parte:
Llevamos el ADN al tercer piso de la Academia, donde se encontraba el espectrofotómetro. Usamos una celda de cuarzo porque las celdas de plástico no trasmiten eficientemente la luz ultravioleta. Medimos las absorbancias a 230 nm, 260 nm (máxima absorción) y 280 nm.

Al concluir el práctico, la Dra. Woods continuó con la explicación teórica acerca de lo que realizaremos la semana entrante (PCR). Luego nos mostró el programa Oligo, utilizado para diseñar primers, que permite identificar los posibles problemas e inconvenientes del diseño (unión de la cadena, temperatura de annealing, de melting, contenido de bases G y C) para obtener el mejor primer posible a la hora de fabricarlo.

Fotos de hoy en: http://www.slide.com/r/IAbJpoLCwz-wsZcy8VSv8bYoiDEOg0_P?previous_view=mscd_embedded_url&view=original